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方案概述

前言：

咖啡因是天然甲基黄嘌呤类生物碱，广泛存在于咖啡豆、茶叶、可可等原料中，是碳酸饮料、能量饮料、茶饮料、咖啡饮品等商品化饮料的核心功能添加剂与特征风味物质。适量摄入咖啡因可起到提神醒脑、缓解疲劳的生理作用，但过量长期摄入易引发心悸、失眠、神经亢奋等不良反应，特殊人群（孕妇、儿童、心血管疾病人群）耐受剂量更低，因此各国食品安全标准均对饮料中咖啡因限量作出明确管控。

我国《食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定》（GB 5009.139-2014）是饮料基质中咖啡因定量检测的法定依据，高效液相色谱法因分离度好、抗基质干扰能力强、定量准确度高，成为各类复合饮料、含乳饮料、草本功能饮料复杂基质样品的首选检测方法。本实验依据 GB 5009.139-2014 标准高效液相色谱法，建立饮料样品前处理与液相分离检测方案，完成不同类型饮料中咖啡因的定性识别与定量分析

关键词：高效液相色谱法；咖啡因；饮料；含量测定。

1.仪器设备及试剂

1.1 液相串联质谱配置清单

表1 仪器配置清单表

序号	名称	数量
1	LC3500液相色谱系统	1台
2	P3500B 二元高压恒流泵	1台
3	CT3500 柱温箱	1台
4	AS3500 超高效自动进样器	1台
5	SmartLab CDS 2.0色谱工作站	1套
6	C18 5 μm 4.6*250 mm	1个

1.2 试剂及标准品清单

表2 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	甲醇	LC级
2	超纯水	—
3	氧化镁	AR级
4	三氯乙酸	AR级

1.3 实验材料及辅助设备

超声波清洗机；

涡旋混合器；

0.45μm微孔水相滤膜。

2.实验方法

2.1 标准溶液配制

2.1.1 咖啡因标准储备液（2.0mg/mL）：准确称取咖啡因标准品20mg（精确至0.1 mg）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。放置于4°C冰箱，有效期为6个月。

2.1.2 咖啡因标准中间液（200μg/mL）：准确吸取5.0mL咖啡因标准储备液（2.1.1）于50mL容量瓶中，用水定容。放置于4°C冰箱，有效期为1个月。

2.1.3 咖啡因标准曲线工作液：分别吸取咖啡因标准中间液（2.1.2）0.5 mL、1.0 mL、2.0mL、5.0mL、10.0 mL至10mL容量瓶中，用水定容。该标准系列浓度分别为10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL。临用时配制。

2.2 样本前处理

2.2.1 可乐型饮料

a）脱气：样品用超声清洗器在40°C下超声5min；

b）净化：称取5g（精确至0.001g）样品，加水定容至5mL（使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内），摇匀，加入0.5g氧化镁，振摇，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。

2.2.2 含乳的咖啡及茶叶液体制品：

称取1g（精确至0.001g）样品，加入三氯乙酸溶液定容至10mL使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内），摇匀，静置，沉降蛋白，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。

2.3实验条件

2.3.1色谱方法条件

色谱柱：C18 4.6*250mm 5μm

流动相：甲醇/水=24/76

流速：1.0 mL/min

柱温：25℃

检测波长：272nm

进样体积：10μL

3.实验结果

3.1 空白

图1 空白溶剂色谱图

3.2 线性范围

图2 咖啡因标准品线性结果

表3 咖啡因标准品线性范围表

待测物质	线性范围	线性相关系数R
咖啡因	10-200μg/mL	1.00000

3.3 重复性

图3 咖啡因标准品重复性色谱图（n=6）

表4 咖啡因标准品重复性色谱参数表（n=6）

序号	样品名称	保留时间（min）	峰面积（mAU*s）
1	咖啡因100μg/mL	7.192	2842.304
2		7.167	2843.223
3		7.158	2846.331
4		7.167	2841.149
5		7.167	2844.688
6		7.192	2844.154
平均		7.174	2843.641
SD		0.014	1.831
RSD（%）		0.202	0.064

3.4 样品

图4 某品牌可乐样品色谱图

表5 某品牌可乐样品色谱结果表

序号	化合物名	保留时间（min）	峰高（mAU）	峰面积（mAU*s）	理论塔板数	拖尾因子	分离度	样品量
1	峰1	2.508	2.976	14.722	5846	1.049	5.859	n.a.
2	峰2	3.300	20.292	113.287	9016	1.471	18.572	n.a.
3	咖啡因	7.225	240.207	2718.737	10379	1.120	n.a.	95.525μg/mL

图5 某品牌奶茶样品色谱图

表6 某品牌奶茶样品色谱结果表

序号	化合物名	保留时间（min）	峰高（mAU）	峰面积（mAU*s）	理论塔板数	拖尾因子	分离度	样品量
1	峰1	2.550	25.229	153.304	4651	1.482	1.196	n.a.
2	峰2	2.767	4.739	28.484	2705	0.938	0.821	n.a.
3	峰3	2.908	13.669	82.811	7711	1.241	3.072	n.a.
4	峰4	3.367	6.123	42.158	6584	0.847	2.789	n.a.
5	峰5	3.850	2.084	14.257	7269	1.038	14.487	n.a.
6	咖啡因	7.208	66.015	740.484	10377	1.094	2.255	26.171μg/mL
7	峰7	7.925	2.316	32.576	8076	0.950	n.a.	n.a.

3.5 加标回收

图6 某品牌可乐样品加标回收色谱图（加标浓度 40μg/mL）

表7 某品牌可乐样品加标回收色谱结果表（加标浓度 40μg/mL）

序号	化合物名	保留时间（min）	峰高（mAU）	峰面积（mAU*s）	理论塔板数	拖尾因子	分离度	样品量	加标回收率
1	峰1	3.300	20.854	157.799	8264	1.512	18.217	n.a.	—
2	咖啡因	7.192	338.236	3802.534	10401	1.158	n.a.	133.521μg/mL	94.99%

图7某品牌奶茶样品加标回收色谱图（加标浓度 40μg/mL）

表8 某品牌奶茶样品加标回收色谱结果表（加标浓度 40μg/mL）

序号	化合物名	保留时间（min）	峰高（mAU）	峰面积（mAU*s）	理论塔板数	拖尾因子	分离度	样品量	加标回收率
1	峰1	3.367	6.042	39.762	6697	0.923	2.828	n.a.	—
2	峰2	3.858	2.233	15.315	7099	1.038	14.375	n.a.	—
3	咖啡因	7.217	163.054	1826.133	10323	1.108	2.301	64.232μg/mL	95.15%
4	峰4	7.967	2.388	35.059	7512	1.048	n.a.	n.a.	—

3.6 检出限

图8 某品牌可乐检出限色谱图

表9 某品牌可乐检出限色谱结果表

序号	化合物名	保留时间（min）	峰面积（mAU*s）	峰高（mAU）	理论塔板数	拖尾因子	信噪比	样品量	检出限(mg/kg)
1	咖啡因	7.150	0.044	0.687	5238	1.048	11.368	0.235μg/mL	0.0446

图9 某品牌奶茶检出限色谱图

表10 某品牌奶茶检出限色谱结果表

序号	化合物名	保留时间（min）	峰高（mAU）	峰面积（mAU*s）	理论塔板数	拖尾因子	信噪比	样品量	检出限(mg/kg)
1	咖啡因	7.142	0.036	0.656	3758	0.948	9.241	0.234μg/mL	0.075

4.结论

本次实验参考GB 5009.139-2014《食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定》，使用英国365集团官网LC3500液相色谱仪搭配二极管阵列检测器，进行饮料中的咖啡因的测定。由数据可得：目标峰峰型对称，理论塔板数高；标准溶液系列浓度10.0 μg/mL~200.0 μg/mL线性相关系数＞0.9999，；重复性好，保留时间及峰面积RSD值均＜0.3%，仪器精密度良好；本次检测可乐、奶茶两种基质，含量分别为95.051 mg/kg、260.0456 mg/kg；加标回收率＞94%，加标回收率高，样品损失少，前处理方法稳定；可乐型饮料检出限为0.0446 mg/kg，含乳茶叶液体饮料检出限为0.75 mg/kg，仪器灵敏度高、噪声低。

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